油橄榄(Olea europaea L.)是世界四大木本油料树种之一，提取的橄榄油因健康、优质和营养丰富受到广泛关注，在世界范围内大量种植^[1]；中国的引种始于上世纪60年代，种植范围遍及南方各省市, 经过几十年对气候、土壤、产量和物候期的观察和测定，划分出适生区域范围^[2]。本世纪初大量从地中海各国引进良种，在甘肃、四川等地大面积种植, 有力地推动油橄榄产业的发展^[3]。但作为外来引进树种，油橄榄生长常因气候^[4]、地理环境^[5]、土壤^[6]、温湿度^[7]等环境的改变，生长状态、果实和叶片性状发生较大变化^[8-10]，与原产地存在差异。叶片作为树木响应环境变化的外在反映器官，与生长密切相关，能充分体现新环境下生长状态，开展叶片表型性状的分析能充分了解品种间生长的差异及叶片内含物变化规律。通过对油橄榄叶片内含物的研究，发现其富含角鲨烯、维生素E、有机酸、蛋白质、氨基酸、橄榄苦苷和黄酮等生物活性成分^[11-15]，且生物活性物质在叶中的含量是果实的1~9倍，是橄榄油的数百倍^[16-18]，具备较强的药用和保健开发价值。随着油橄榄种植面积的扩大，冬季整形修剪所产生的大量枝叶等废弃物，常遗留于地块或者大量堆积, 不仅易造成火灾隐患也对环境造成污染^[19-21]，因此生产上面临如何解决废弃物的利用问题。

目前国内对油橄榄叶片总黄酮含量受加工方式^[22]和季节^[23]等影响的变化规律的研究较多，但对叶片性状变化及与总黄酮含量间的相关性研究较少^[24]。由于国内无原生油橄榄种质资源，多从国外引进，因此有必要对现有资源的性状进行分析，摸清油橄榄品种叶片变化规律，研究品种间叶片性状与总黄酮含量之间的差异与相关性，为后期油橄榄叶片的综合利用开发提供技术支持，并为新品种培育提供帮助。

试验地位于四川省青川县沙州镇，属亚热带温润季风气候，年平均气温13.7℃，年降水量1027.2 mm。≥10℃年积温为5028℃，≥19℃年积温为4247℃，气温从东至西逐渐降低。日照时数1292 h，年无霜期243 d，空气湿度69%~85%，多年平均水面蒸发量727.9 mm，陆面蒸发量546.1 mm。土壤为山地黄壤，pH为6.5~7.5，土层厚度在40~80 cm。

油橄榄(Olea europaea L.)叶片采自四川省青川县青源林农产品有限责任公司油橄榄品种园内，在造林5年的林分内选取‘埃蒙’(Empetry)、‘佛奥’ (Frantoio)、‘莱星’(Leccion)、‘小苹果’(Manzalia)、‘豆果’(Arbequina)、‘科拉蒂’(Coratina)、‘皮削利’(Picholine)、‘卡林’(Kalinjot)、‘鄂植8号’和‘钟山24号’共10个品种。

芦丁对照品经中国药品生物制品检定所检定; 甲醇、乙醇、AlCl₃、Al(NO₃)₃、NaNO₂、CH₃COOK、NaOH均为分析纯；水为Ⅰ级水。

电热恒温鼓风干燥箱(南京实验仪器厂); AE100电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；SHZ-88台式水浴恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；台式超声波清洗器(总功率300W) (上海科导超声仪器有限公司)；超纯水机(美国热电公司)；723N可见分光光度计(上海精科仪器有限公司)。

叶片性状测定 为保证叶片生长完整，2015年12月中旬采集当年春梢上的新鲜叶片100张, 每个品种采集3株树，用自封袋装好，带回实验室。将采集后的叶片平铺于EPSON700扫描仪，对叶片进行扫描；利用WinFOLIA (Pro 2005) 软件进行叶片形态特征分析，测量叶长、叶宽、叶面积和周长, 计算叶片长宽比和形状系数等。

总黄酮含量测定 参照钟冬莲^[25]的方法测定叶片的总黄酮含量。精确称取芦丁对照品0.0050 g, 置于小烧杯中，加体积分数70%甲醇溶液后, 移入100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀配制成质量浓度为0.0500 mg mL^-1溶液。将新鲜的油橄榄叶片洗净、擦干，于室温下粉碎，称取4份0.5~1 g，精确至0.0001 g的样品放入250 mL的带塞锥形瓶中。先往锥形瓶中加入30 mL提取液，盖上瓶塞，在210 W功率、50℃下超声1 h，趁热过滤，分别用提取液洗涤滤纸和锥形瓶，最后用提取液定容至50 mL，摇匀。取1 mL样品溶液置于10 mL的比色管中，加入0.1 mol L^-1 AlCl₃溶液2 mL，加入1 mol L^-1的乙酸钾溶液3 mL，用70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，室温下放置30 min，于420 nm波长处用分光光度计比色法测定。

在Excel 2010中计算各性状的变异系数(CV) (标准差/平均数)作为叶片形态变异度的测度。运用SPSS 19.0单因素方差分析法(One-Way ANOVA)的LSD和Duncan检验对叶片的性状指标和总黄酮含量指标进行方差分析；用主成分分析法反映性状的综合指标；用双侧检验法开展相关性分析摸清叶片性状与总黄酮含量之间的相关性。

对油橄榄叶片性状进行方差分析和多重比较表明(表 1)，油橄榄品种间叶片的叶面积、周长、长度、宽度、长宽比和形状系数的差异均达到显著水平。以‘钟山24号’的叶面积、叶长最大；‘小苹果’的长宽比最大，叶宽最小；‘皮削利’的形状系数、周长、叶面积最小；‘鄂植8号’的叶片长度、长宽比最小。叶片各性状的变异系数分别为周长(9.05%)、叶宽(9.03%)、形状系数(8.18%)、叶长(8.15%)、叶长宽比(7.28%)和叶面积(5.60%)。不同品种叶片性状的变异系数分别为叶面积2.88%~9.14%、周长5.66%~12.87%、叶宽4.86%~13.26%、叶长4.24%~ 10.93%、叶长宽比3.97%~11.60%、形状系数3.91%~ 15.46%；其中叶面积变异系数最大的是‘鄂植8号’，最小的是‘皮削利’；周长最大的是‘鄂植8号’，最小的是‘卡林’；叶宽最大为‘莱星’，最小为‘皮削利’; 叶长最大为‘莱星’，最小为‘卡林’；叶片长宽比最大为‘小苹果’，最小为‘豆果’；形状系数最大为‘埃蒙’，‘皮削利’最小。这表明‘鄂植8号’叶片形态变化较为明显，而‘皮削利’的叶片形态差异较小；‘埃蒙’的叶片形状系数最大，而‘皮削利’最小, 说明‘埃蒙’的叶片形状变化多样，‘皮削利’叶片形状较为稳定。

表 1(Table 1)

表 1 油橄榄品种的叶片性状特征 Table 1 Leaf characters of Olea europaea varieties ‘小苹果’ ‘Manzalia’ ‘科拉蒂 ‘Coratina’ ‘鄂植8号 ‘E’zhi 8’ ‘埃蒙 ‘Empetry’ ‘佛奥 ‘Frantoio’ ‘卡林 ‘Kalinjot’ 面积 Area (cm2) 最小 Min. 2.40 3.43 3.19 4.23 4.25 5.45 最大 Max. 4.90 6.99 5.06 7.80 8.99 10.45 平均 Mean 3.70±0.53Bb 4.70±1.10Cc 4.11±0.43B Cbc 6.58±1.03Dd 5.99±1.37Cd 7.85±1.56Ee CV 6.97 4.25 9.60 6.37 4.37 5.02 周长 Perimeter (cm) 最小 Min. 9.06 10.75 8.81 11.70 11.08 12.38 最大 Max. 14.15 15.04 11.92 16.11 16.09 21.14 平均 Mean 12.24±1.02Cc 13.00±1.34Cc 10.53±0.86Bb 14.66±1.14Dd 13.31±1.37CDc 17.52±3.10Ee CV 12.02 9.67 12.28 12.87 9.74 5.66 叶宽 Width (cm) 最小 Min. 0.91 1.02 1.22 1.25 1.24 1.46 最大 Max. 1.24 1.69 1.69 2.34 2.01 1.86 平均 Mean 1.03±0.08Aa 1.24±0.0.18Bb 1.44±0.12CDEcd 1.61±0.25EFef 1.58±0.22EFef 1.66±0.13Ff CV 12.75 6.72 12.35 6.51 7.08 12.88 叶长 Length (cm) 最小 Min. 3.87 3.72 3.35 3.82 4.23 4.94 最大 Max. 5.89 6.23 5.11 7.03 6.35 8.19 平均 Mean 5.05±0.49ABbc 5.23±0.69BCbc 4.33±0.47Aa 5.92±0.79Cd 5.40±0.61BCcd 6.63±1.14De CV 10.3 7.56 9.28 7.50 8.84 5.79 长宽比 Ratio of length to width 最小 Min. 4.16 3.23 2.30 1.64 2.93 2.91 最大 Max. 5.57 5.04 3.92 4.48 4.71 4.99 平均 Mean 4.89±0.42Ee 4.27±0.55CDEd 3.04±0.48Aa 3.77±0.68BCDbc 3.44±0.42ABab 4.01±0.76BCDcd CV 11.60 7.77 6.35 5.59 8.14 5.26 形状系数 Shape coefficient 最小 Min. 0.28 0.30 0.37 0.34 0.29 0.25 最大 Max. 0.37 0.40 0.57 0.43 0.55 0.46 平均 Mean 0.31±0.03Aa 0.35±0.03ABab 0.47 ±0.06Bc 0.38±0.02ABabc 0.42±0.06ABbc 0.33±0.07Aab CV 12.3 10.16 7.61 15.46 7.09 4.44 ‘钟山24号’ ‘Zhongshan 24’ ‘皮削利’ ‘Pichnolia’ ‘莱星’ ‘Leccion’ ‘豆果’ ‘Arbequina’ CV 面积 Area (cm2) 最小 Min. 6.39 1.20 1.00 2.57 最大 Max. 11.83 3.25 4.22 7.19 平均 Mean 9.08±1.79Ff 1.99±0.69Aa 2.67±0.82Aa 4.52±1.15BCc CV 5.07 2.88 3.25 9.14 5.60 周长 Perimeter (cm) 最小 Min. 15.20 4.31 4.50 15.33 最大 Max. 20.65 7.84 7.84 15.33 平均 Mean 17.18±1.79Ee 5.95±0.94Aa 6.28±1.01Aa 12.69±1.89Cc CV 9.57 6.32 6.22 6.71 9.05 叶宽 Width (cm) 最小 Min. 1.46 0.96 1.25 0.95 最大 Max. 2.29 1.85 1.68 1.66 平均 Mean 1.88±0.24Gg 1.26±0.26BCb 1.50±0.11DEFde 1.34±0.18BCDbc CV 7.94 4.86 13.26 7.53 9.03 叶长 Length (cm) 最小 Min. 5.98 4.35 4.11 2.54 最大 Max. 8.59 6.40 5.74 6.59 平均 Mean 6.93±0.87De 5.34±0.59BCbc 5.13±0.47Bbc 4.86±1.14ABab CV 7.99 9.08 10.93 4.24 8.15 长宽比 Ratio of Length to width 最小 Min. 3.14 2.52 2.79 1.75 最大 Max. 4.32 5.73 4.23 5.41 平均 Mean 3.72±0.40BCbc 4.39±0.86DEd 3.42±0.32ABab 3.67±0.92ABCbc CV 9.32 5.10 10.68 3.97 7.28 形状系数 Shape coefficient 最小 Min. 0.23 0.17 0.62 0.27 最大 Max. 0.32 0.40 1.11 0.48 平均 Mean 0.27±0.03ABabc 0.23±0.07Cd 0.84±0.13Cd 0.35±0.06ABab CV 9.30 3.91 6.30 6.28 8.18 CV:变异系数。同行数据后不同大小写字母分别表示差异极显著(P < 0.01) 和显著(P < 0.05)。 CV: Variation coefficience. Data followed different capital and small lettrs in the same line indicate significant difference at 0.01 and 0.05 levels, respectively.

表 1 油橄榄品种的叶片性状特征 Table 1 Leaf characters of Olea europaea varieties

相关性分析结果表明(表 2)，油橄榄的叶面积与周长、叶长、叶宽存在极显著正相关，与形状系数存在极显著负相关；周长与叶长、叶宽存在极显著正相关，与形状系数存在极显著负相关；叶宽与叶长、形状系数存在极显著正相关，与叶片长宽比存在极显著负相关；叶宽与叶片长宽比存在极显著正相关，与形状系数存在极显著或显著负相关；长宽比与形状系数存在极显著负相关。这说明随着油橄榄叶面积的增大，叶片形态并不随之发生变化，而是受到叶长和叶宽的影响。

表 2(Table 2)

表 2 油橄榄叶片性状的相关性 Table 2 Correlation among leaf characters of Olea europaea 叶面积 Area 周长 Perimeter 宽 Width 长 Length 长宽比 Ratio of length to width 形状系数 Shape coefficient 叶面积 Area 1 周长 Perimeter 0.883** 1 叶宽 Width 0.669** 0.328** 1 叶长 Length 0.661** 0.556** 0.356** 1 叶长宽比 Ratio of length to width -0.061 0.169* -0.595** 0.506** 1 叶形状系数 Shape coefficient -0.359** -0.690** 0.228** -0.115 -0.312** 1 *: P < 0.05; **: P < 0.01.

表 2 油橄榄叶片性状的相关性 Table 2 Correlation among leaf characters of Olea europaea

由于油橄榄叶片各性状间存在相关性，利用主成分分析对各性状进行归类分析。结果表明(表 3)，前3个主成分的特征值 > 1，累积贡献率达到97.35%, 第一个主成分的贡献率最大, 为49.06%，其次为第二和第三主成分的贡献率，分别为31.32%和17.06%;对主成分进行旋转因子分析(表 4)，第一主成分由叶面积、周长、叶长、叶宽和形状系数决定；第二主成分由叶宽、叶长宽比和形状系数决定；第三主成分由叶长和形状系数决定；形状系数出现在第一、二和三主成分，叶长出现第一和第三主成分中，说明形状系数和叶长是决定叶片性状的主要因素。

表 3(Table 3)

表 3 主成分特征值、贡献率及累计贡献率 Table 3 Eigen value, contribution rate and accumulative contribution rate of principal components 成份 Principal component 特征值 Eigen value 贡献率(%) Contribution rate 累积贡献率(%) Accumulate contribution rate 1 2.944 49.064 49.064 2 1.873 31.223 80.288 3 1.024 17.064 97.352 4 0.116 1.930 99.282 5 0.024 0.408 99.69 6 0.019 0.310 100

表 3 主成分特征值、贡献率及累计贡献率 Table 3 Eigen value, contribution rate and accumulative contribution rate of principal components

表 4(Table 4)

表 4 主成分分析因子载荷 Table 4 Factor loading of principal components 主成分 Principal component 1 2 3 叶面积 Leaf area 0.954 0.249 -0.031 周长 Leaf perimeter 0.940 -0.124 -0.263 叶宽 Leaf Width 0.511 0.835 0.109 叶长 leaf length 0.764 -0.134 0.615 叶长宽比 Ratio of length to width 0.179 -0.884 0.422 形状系数 Shape coefficient -0.524 0.548 0.620

表 4 主成分分析因子载荷 Table 4 Factor loading of principal components

对油橄榄春梢和秋梢叶片的总黄酮含量进行方差分析和多重比较(表 5)，除‘卡林’和‘鄂植8号’春梢间的总黄酮含量存在显著差异外，其他品种间无显著差异。秋梢叶片的总黄酮含量在品种间的差异显著；‘佛奥’、‘卡林’、‘小苹果’、‘莱星’和‘埃蒙’、‘豆果’间无显著差异，‘科拉蒂’和‘豆果’存在显著差异，‘皮削利’和‘鄂植8号’无显著差异，且与其他8个品种存在显著差异。

表 5(Table 5)

表 5 春梢和秋梢叶片的总黄酮含量 Table 5 Content of total flavonoids in leaves of spring and autumn shoots 春梢 Spring shoot 秋梢 Autumn shoot 佛奥 Frantoio 6.98±1.65ab 7.06±1.27abc 钟山24号 Zhongshan 24 7.09±5.03ab 3.71±1.32ab 豆果 Arbequina 6.39±1.37ab 2.64±0.35a 科拉蒂 Coratina 8.36±7.05ab 8.77±5.78bc 埃蒙 Empetry 7.20±1.55ab 5.67±4.00abc 皮削利 Picholine 6.22±4.65ab 9.61±2.11d 卡林 Kalinjot 3.02±2.10a 5.25±0.39abc 小苹果 Manzanlia 6.03±3.18ab 5.60±1.42abc 莱星 Leccion 7.05±0.54ab 6.56±0.62abc 鄂植8号 E’zhi 8 11.03±5.57c 9.52±3.93d

表 5 春梢和秋梢叶片的总黄酮含量 Table 5 Content of total flavonoids in leaves of spring and autumn shoots

相关分析表明(表 6)，‘科拉蒂’叶片的总黄酮含量与叶面积和叶长呈显著负相关；‘钟山24号’的与叶面积存在极显著负相关，表明随叶面积、叶长的增加，总黄酮含量下降；‘鄂植8号’的与叶面积存在显著正相关，‘埃蒙’的与形状系数存在极显著正相关，表明含量随叶面积或形状系数的增加而上升；其他品种叶片的总黄酮含量与叶片性状间无显著相关性。

表 6(Table 6)

表 6 油橄榄叶片性状与总黄酮含量的相关性 Table 6 Correlation between leaf characters and content of total flavonoids in Olea europaea 叶面积 Leaf area 周长 Perimeter 宽度 Width 长度 Length 长宽比 Ratio of length to width 形状系数 Shape coefficient ‘小苹果’ ‘Manzalia’ -0.506 -0.058 -0.543 0.303 0.669 -0.579 ‘科拉蒂’ ‘Coratina’ -0.853* -0.640 -0.650 -0.885* -0.040 -0.583 ‘鄂植8号 ‘E’zhi 8’ 0.815* 0.503 0.543 0.596 -0.030 0.154 ‘埃蒙’ ‘Empetry’ 0.667 -0.308 0.567 -0.155 -0.395 0.959** ‘佛奥’ ‘Frantoio’ 0.139 0.209 0.050 0.037 -0.048 -0.151 ‘卡林’ ‘Kalinjot’ 0.544 0.671 0.461 0.389 0.280 -0.763 ‘钟山24号’ ‘Zhongshan 24’ -0.996** -0.904 -0.838 -0.819 0.037 -0.093 ‘皮削利’ ‘Picholine’ 0.544 0.655 -0.336 -0.422 0.761 -0.785 ‘莱星’ ‘Leccion’ 0.029 0.382 0.229 -0.667 -0.542 -0.350 ‘豆果’ ‘Arbequnia’ -0.216 -0.165 -0.488 -0.134 -0.053 0

表 6 油橄榄叶片性状与总黄酮含量的相关性 Table 6 Correlation between leaf characters and content of total flavonoids in Olea europaea

通过对10个品种叶片性状进行分析，结果表明性状间的差异均达到显著水平，以‘钟山24号’的叶面积最大，‘皮削利’的最小。各性状的变异系数以周长最大，叶面积最小；‘鄂植8号’的叶面积变异系数最大，‘莱星’叶长和叶宽的变化较大，‘小苹果’的叶长宽比变化明显，‘埃蒙’的叶片形状变化较大, ‘皮削利’的叶片性状最为稳定。

相关分析表明叶片性状间存在极显著或显著相关，且叶片形态的变化更多受到叶长和叶宽的影响，而不是叶片面积。主成分分析结果表明，油橄榄叶片性状中前3个主成分的累积贡献率为97.35%, 能够代表叶片性状的全部信息，形状系数和叶长是决定叶片性状的主要因素。

油橄榄叶片总黄酮含量为0.07~0.39 mg g^-1，品种间存在显著差异，体现为春梢含量总体高于秋梢。‘皮削利’、‘豆果’、‘钟山24号’和‘卡林’春秋梢叶片含量差异较大，‘佛奥’的最小；‘鄂植8号’和‘科拉蒂’的春秋梢叶片总黄酮含量较高，具有较好的开发价值；‘皮削利’的秋梢好于春梢；春梢中‘卡林’总黄酮含量最小，为3.02 mg g^-1，秋梢中‘豆果’的最低，为2.64 mg g^-1。本研究结果高于与前人报道的1.0 mg g^-1[22]和3.2 mg g^-1[23]，但低于青钱柳(Cyclocarya paliurus)^[26]，与银杏(Ginkgo biloba)的持平^[27]。目前油橄榄叶片综合利用开发在国内还处于试验阶段，但国外的开发较为成熟，橄榄叶片粉末或提取物，广泛用于保健、医药和化妆品行业^[28]。

油橄榄春梢叶片总黄酮含量除‘鄂植8号’外品种间无显著差异，秋梢的品种间差异显著，可能是春梢生长周期长，总黄酮含量在品种间的差异逐渐缩小，而‘鄂植8号’则因生长旺盛，与其他品种存在显著差异。秋梢的叶片则可能因生长周期短，品种间总黄酮产生机制存在差异，从而表现出总黄酮含量的品种差异性。‘豆果’叶片春秋梢的总黄酮含量存在显著差异，且秋梢高于春梢，可能是秋梢新叶中总黄酮合成较快，含量提升明显。李向婷等^[23]认为冬季叶片总黄酮含量最高，本研究中大部分品种与其相符，但部分品种受自身遗传特性影响，总黄酮含量变化与之相反，如‘皮削利’和‘豆果’。这可能是叶片受采摘时间和位置的影响，含量变化出现差异。‘科拉蒂’、‘钟山24号’、‘埃蒙’和‘鄂植8号’的总黄酮含量与叶面积存在显著和极显著的正相关或负相关关系，说明总黄酮含量变化受到叶片生长的影响。

随着橄榄油消费市场的兴起，促进油橄榄在国内种植面积的不断扩大，由最初局部地区，逐渐扩散到南方各省，但由于品种、气候和土壤等多种因素影响, 果实产量上往往达不到预期要求，制约油橄榄种植范围的扩大。本研究结果表明，油橄榄品种间叶片次生代谢物含量差异及其与叶形的关系, 说明油橄榄不仅果实具有较高价值，叶片也可以作为一种经营模式的选择，可以由传统果用为主，转变为果叶兼用或者叶用为主，提高油橄榄种植园的经济效益；同时通过对废弃物的综合利用，可降低油橄榄叶片内化合物成分所导致的农业面源污染, 使其兼具生态和经济意义。本研究只是对局部地区油橄榄叶片总黄酮含量及叶片性状进行分析，对于环境、土壤和营养等因素的影响还有待于进一步研究。