随着全球变暖和气候异常，果树的生产栽培面临着高温胁迫的严峻挑战，成为影响果树产业发展的重要因素之一。柑橘 (Citrus reticulata) 在受到高温胁迫的情况下光合速率明显降低，叶片光系统活性的光化学效率也明显下降^[1]。苹果 (Malus pumila) 果实受到高温胁迫，O₂^—˙含量增加，其超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 和过氧化物酶 (Peroxidase, POD) 活性下降且丙二醛 (MDA) 含量增加，细胞的膜脂过氧化作用加重^[2]。葡萄 (Vitis vinfera) 在正常光照下，40℃高温胁迫导致其叶片的Pn显著下降 (不是气孔因子导致的结果，而是与非气孔因子PSⅡ供体侧和反应中心活性以及激发能分配有关)，不过能够较快地恢复^[3]。高温胁迫对枣树 (Ziziphus jujuba) 幼苗叶片相对含水量的影响并不明显，但随着高温胁迫的加剧，细胞膜脂过氧化程度和破坏程度增加，同时细胞失水也越来越严重^[4]。早期王进等^[5]对早熟梨的研究表明，高温胁迫会引起梨叶片的早期脱落，且叶片开始脱落的时间和完全脱落时间随胁迫时间的延长而提前。高温胁迫对梨的生理效应和伤害机理研究报道较少，因此，开展对梨的高温适应性研究十分必要。

高温胁迫过程中，果树会发生氧代谢失调，过氧化氢 (H₂O₂) 增多，若不及时清除，会引起细胞的破坏。而抗坏血酸过氧化物酶 (Ascorbate peroxidase, APX) 是利用抗坏血酸 (Ascorbic acid, AsA) 为电子供体的H₂O₂的清除剂^[6]。高温胁迫下果树体内各种酶活性下降，生理代谢发生紊乱，内源激素脱落酸 (Abscisic acid, ABA) 能维持SOD和POD的活性, 有效降低膜脂过氧化作用。9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶 (9-cis-Epoxycarotenoid dioxygenase, NCED) 是高等植物ABA生物合成的关键酶之一^[7-8]。高温胁迫会导致吲哚乙酸 (Indole-3-acetic acid, IAA) 含量降低，使果树生长速率减慢，从而缓解因水分不足对植株完成正常生理活动造成的压力。而生长素酰胺合成酶 (Gretchen hagen 3, GH3) 是果树IAA生物合成的关键酶之一^[9-10]。因此，APX、NCED和GH3基因在缓解果树受高温胁迫伤害起着重要的作用。

‘黄冠’(Pyrus pyrifolia Nakai ‘Cuiguan’) 和‘翠玉’(P. bretschneideri×P. pyrifolia) 梨是我国广为栽培的优良品种，深受广大消费者喜爱。本试验以盆栽梨苗进行高温处理，测定叶片的抗氧化酶活性、抗氧化物质和渗透调节物质含量，采用qRT-PCR方法分析叶片中APX、NCED和GH3基因表达量的变化，以探讨高温胁迫对梨叶片的影响，为梨的抗热性研究奠定理论基础。

选取大小、长势基本一致，叶片完全成熟的‘黄冠’(Pyrus pyrifolia Nakai‘Cuiguan’)、‘翠玉’(P. bretschneideri×P. pyrifolia) 品种2年生幼苗各9株, 在高温胁迫前1周左右将幼苗移至人工气候室，3株为1小区，光暗周期12 h/12 h, 日夜温度25℃/ 17℃，光照强度72 μmol m^-2s^-1，相对湿度为75%。

高温胁迫期间湿度保持在78%，光暗周期12 h/ 12 h。将1 d分为6个时间段 (20:00-24:00、0:00-04:00、04:00-08:00、08:00-12:00、12:00-16:00和16:00-20:00)，对应的温度为32℃、36℃、40℃、42℃、38℃和36℃。材料在人工气候室内随机排列，高温胁迫期间每天18:00浇1次水，以保证水分充足，并按照顺序变换位置以保证生长条件一致。梨幼苗高温处理8 d，每2 d取1次叶片，取样时间定为13:00，取样按照上、中、下随机取样，以未处理植株为对照。重复3次。叶片经液氮速冻后保存于-80℃冰箱中。

叶绿素含量、丙二醛 (MDA)、抗坏血酸 (ASA) 含量和脯氨酸 (Pro) 含量参照陈建勋等^[11]的方法进行测定。

过氧化物酶 (POD) 和过氧化氢酶 (CAT) 活性参照高俊凤等^[12]的方法测定。

采用反相高效液相色谱HPLC技术，参考前人^[13-16]的方法测定内源激素含量。

分别以‘黄冠’和‘翠玉’高温处理0、2、4、6和8 d的叶片总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，根据NCBI已获得的NCED、GH3和APX基因的全长序列，使用Primer premier 5.0设计特异性引物PbNCED-F和PbNCED-R、PbGH3-F和PbGH3-R、PbAPX-F和PbAPX-R (表 1)，以梨Actin基因为内参，引物为Actin-F和Actin-R，3次重复。使用STEPONE荧光定量PCR仪进行定量分析，试剂采用TaKaRa公司的SYBR® Premix Ex Taq^TM Ⅱ, 操作按照试剂说明书进行，采用2^-△△CT公式计算基因相对表达量。

表 1(Table 1)

表 1 荧光定量PCR扩增所需引物及其序列 Table 1 qRT-PCR amplification required primers and sequences 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) PbNCED-F GTACGGTGGTGACCGTTTT PbAPX-F TCGGACACGGAGAGGGAAA PbNCED-R ACCGTAGCCTCCAACTTCAT PbAPX-R ATCCGTAAAGATGAACCGGCA PbGH3-F GTGTGTGAATTTCTCGCCCATC Actin-F TGGTGTCATGGTTGGTATGG PbGH3-R CTACGTTGTTCTGGGGTCCA Actin-R CAGGAGCAACACGAAGTTCA

表 1 荧光定量PCR扩增所需引物及其序列 Table 1 qRT-PCR amplification required primers and sequences

在高温胁迫下, ‘黄冠’和‘翠玉’叶片中的叶绿素含量均随胁迫时间的延长而下降。‘黄冠’叶片中的叶绿素含量在胁迫8 d时与胁迫0 d时相比下降了33.0%，‘翠玉’的下降了31.9%。同时，‘黄冠’叶片中的叶绿素含量在胁迫期间一直比‘翠玉’中的含量高 (图 1: A)。

图 1(Fig. 1)

图 1 高温胁迫对梨叶片中叶绿素 (A)、MAD (B)、Pro (C)、ASA (D) 含量、POD (E) 和CAT (F) 活性的影响 Fig. 1 Effects of high temperature stress on contents of chlorophyll (A), MAD (B), Pro (C), ASA (D), activities of POD (E) and CAT (F) in 'Huangguan' and 'Cuiyu'

在高温胁迫下，‘黄冠’和‘翠玉’叶片中MDA含量均持续增加。胁迫处理2 d的‘黄冠’叶片MDA含量比处理前增加了33.6%，处理4 d后又增加了8.5%，处理6 d又增加了33.2%，处理8 d又增加了19.5%。胁迫2 d的‘翠玉’叶片MDA含量比处理前增加了21.7%；处理4 d比处理前略微下降了0.8%；处理6 d又增加了20.8%；处理8 d比处理前增加了12.3%。说明细胞膜在高温胁迫下受到了一定程度的伤害，而且‘翠玉’受到的影响大于‘黄冠’(图 1: B)。

在高温胁迫下, ‘黄冠’和‘翠玉’叶片中Pro含量都随胁迫时间的延长而显著增加 (图 1: D)。高温胁迫处理8 d的‘黄冠’叶片Pro含量比处理前增加了117.6%；处理的前2 d增长缓慢，仅增加了17.3%，处理4 d的增长速率加快，增加了102.6%，处理6~8 d缓慢增长了19.4%。‘翠玉’叶片中的Pro含量在处理前期增长缓慢，增幅为14.3%；处理2 d后增长加快，增幅为93.2%；处理4~6 d和6~8 d的增长较慢，分别增加了20.5%和0.7%。可见，‘黄冠’和‘翠玉’都是抗旱性较强的品种，但相比而言, ‘黄冠’的抗旱性要强于‘翠玉’。

在高温胁迫下，‘黄冠’和‘翠玉’叶片中ASA含量的变化趋势相同，均为先升高后下降 (图 1: C)。在胁迫前2 d ‘黄冠’叶片中的ASA含量增长较快, 与处理前相比增加了149.4%；胁迫处理6 d后，ASA含量持续下降，下降了37.6%。而‘翠玉’叶片中的ASA含量在处理前2 d增加了142.6%，在处理4 d、6 d和8 d分别下降了18.9%、18.2%和33.7%；可以看出‘翠玉’受到高温胁迫的影响比‘黄冠’大。

在高温胁迫下，‘黄冠’和‘翠玉’叶片的POD活性均表现为先下降后上升再下降的趋势 (图 1: E)。‘黄冠’和‘翠玉’叶片POD活性在处理前4 d持续下降，胁迫2 d‘黄冠’和‘翠玉’叶片的POD活性与处理前分别下降17.7%和10.2%，处理4 d又分别下降了36.4%和25.4%，‘黄冠’叶片POD活性下降幅度比‘翠玉’大。处理6 d‘黄冠’和‘翠玉’叶片的POD活性分别比处理前上升了13.4%和13.1%，处理8 d‘黄冠’叶片的POD活性与处理前的下降幅度比‘翠玉’小，‘翠玉’下降了37.1%，而‘黄冠’只下降了23.5%。高温胁迫对‘黄冠’叶片POD活性的影响与‘翠玉’基本相似，均随胁迫时间的延长POD活性下降。

高温胁迫下，‘黄冠’叶片的CAT活性呈先下降后上升再下降的趋势，而‘翠玉’的呈“W”形 (图 1: F)。处理2 d‘黄冠’叶片的CAT活性急剧下降，下降了60.7%，‘翠玉’的下降了59.6%，均降至低谷。处理4 d时‘黄冠’和‘翠玉’叶片的CAT活性比处理前分别上升了107.6%和383.6%。处理6 d时‘黄冠’叶片的CAT活性缓慢下降，降幅为11.2%，同期‘翠玉’下降了72.2%。处理8 d‘黄冠’叶片的CAT活性继续下降，降幅为16.7%，而‘翠玉’急剧上升，增加了375.61%。胁迫初期‘黄冠’叶片CAT活性比‘翠玉’高，随着胁迫时间的延长，‘黄冠’叶片的CAT活性下降，而‘翠玉’上升，后期‘翠玉’高于‘黄冠’，表明‘翠玉’叶片清除活化氧的能力低于‘黄冠’。

‘黄冠’叶片中IAA含量呈先增加后下降趋势, 而‘翠玉’的呈阶梯状起伏 (图 2: A)。‘黄冠’的变化幅度比较大，而‘翠玉’的较小，并且‘黄冠’叶片中IAA含量始终比‘翠玉’高。高温处理的第4天，IAA含量在两种梨叶片中的变化趋势都发生了改变，说明第4天是其生理变化的转折点。

图 2(Fig. 2)

图 2 高温处理‘黄冠’和‘翠玉’叶片的IAA (A) 和ABA (B) 含量 Fig. 2 Contents of IAA and ABA in leaves of 'Huangguan' (A) and 'Cuiyu' (B)

‘黄冠’和‘翠玉’叶片中ABA含量整体呈上升趋势，‘翠玉’的ABA含量均比‘黄冠’低 (图 2: B)。高温胁迫下两种梨叶片中的ABA含量升高，说明ABA能缓解因高温胁迫造成的水分亏缺。

在高温胁迫下，PbAPX基因在‘黄冠’和‘翠玉’叶片中的表达量均先下降再升高，且以处理2 d时最低 (图 3: A)。‘黄冠’叶片中PbAPX基因表达量均高于‘翠玉’, 这与高温胁迫下ASA含量的变化趋势一致，说明‘黄冠’抵御膜脂过氧化的能力强于‘翠玉’。

图 3(Fig. 3)

图 3 高温处理‘黄冠’和‘翠玉’叶片中PbAPX(A)、PbGH3(B) 和PbNCED(C) 基因表达 Fig. 3 Relative expression of PbAPX (A), PbGH3 (B) and PbNCED (C) in leaves of 'Huangguan' and 'Cuiyu'

在高温胁迫下，PbGH3基因在两种梨叶片中以处理4 d时的表达量最大，除对照外，‘黄冠’叶片中PbGH3基因表达量都要高于‘翠玉’(图 3: B)。这与高温胁迫4 d时IAA含量达到最大相吻合。在高温胁迫4 d、6 d和8 d时，PbGH3基因在‘黄冠’和‘翠玉’中的表达量均存在显著差异。

PbNCED基因在‘黄冠’叶片中的表达量呈阶梯状起伏，而‘翠玉’呈先减少后增加趋势，且均以对照的表达量最高 (图 3: C)。这与ABA在高温胁迫下的变化趋势基本吻合。高温胁迫下，PbNCED基因在‘黄冠’和‘翠玉’叶片中的表达量均存在显著性差异。

将本试验中ASA、IAA和ABA含量分别与PbAXP、PbGH3和PbNCED基因表达量进行相关性分析。结果表明，‘黄冠’和‘翠玉’中PbAXP表达量与ASA含量均呈显著负相关，相关系数分别为-0.913和-0.747, 这是由于PbAXP是合成抗坏血酸过氧化物酶的基因，当基因表达下降时，ASA的含量呈上升趋势；‘黄冠’的PbGH3基因表达量与IAA含量呈显著正相关，相关系数为0.884；但‘翠玉’的PbGH3表达量与IAA含量呈正相关，相关系数为0.447。‘黄冠’的PbNCED基因表达量与ABA含量呈负相关，相关系数为-0.308，‘翠玉’中则表现为正相关，相关系数为0.386。

植物在受到高温胁迫时，其内部生理生化反应和基因表达都会发生一系列变化，主要表现为光合作用下降, 呼吸作用减弱，细胞膜透性增大，活性氧的含量增加, 启动抗氧化酶和非酶抗氧化物质发生应答性变化^[17]。

从生理方面来说，经过高温胁迫后的梨树，叶片中的叶绿素相对含量、净光合速率和PSⅡ的最大光化学效率都有所下降。在本研究中，经过高温处理后，‘黄冠’和‘翠玉’叶片中抗氧化物质、抗氧化酶、渗透性物质含量发生了显著变化。叶绿素含量发生明显的下降，同时MDA含量表现为持续的上升, 这与罗聪等^[19]的研究结果一致；保护酶方面，两种梨中的POD和CAT活性总体表现为下降趋势，但‘黄冠’中POD和CAT的含量均高于‘翠玉’这表明‘黄冠’中保护酶的保护能力要强于‘翠玉’。这与刘冬峰等对‘翠冠’和‘圆黄’梨进行短期持续高温胁迫处理和长时间高温胁迫处理的结果一致^[18]。

植物体内抗氧化物质含量被认为是植物在逆境胁迫下受伤害的指标^[20]，本试验中ASA含量在‘黄冠’和‘翠玉’叶片中均为先升高后下降的趋势，这与PbAPX基因的表达量相反，这是由于APX用于清除ASA产生的过氧化氢，当ASA含量下降后植物需要较多的APX清除过氧化氢，这说明高温胁迫后‘黄冠’细胞膜的过氧化程度比‘翠玉’轻、抗逆性更强。

抗氧化酶是植物体内的保护酶，在植物受到胁迫伤害时能清除体内的活性氧和自由基，植物体中的保护酶系统如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等可以清除活性氧自由基，防止自由基的毒害，使自由基保持在较低的水平^[21]。但随着高温胁迫程度加强，植物自身的抗氧化酶逐渐减少，酶活性下降，导致植物活性氧的积累^[21]。ASA是植物在逆境胁迫环境下非常重要的抗氧化物质，是启动氧化还原途径ASA-GSH的重要组分^[22]。本研究结果表明，‘黄冠’清除体内活性氧和自由基的能力要比‘翠玉’强，在高温胁迫的第2天ASA-GSH循环开始启动，ASA不断被消耗，从而抵抗外界的胁迫影响。植物体内的内源激素在植物受到逆境条件下会促进气孔关闭，减少水分的散失, 提高植株对水分的调节能力^[23-24]。

‘黄冠’的渗透调节物质MDA和PRO含量都高于‘翠玉’，这也解释了‘黄冠’的耐热性要高于‘翠玉’。在内源激素方面，IAA和ABA含量都随着处理时间的延长呈下降趋势，但‘黄冠’叶片中的含量都比‘翠玉’高，IAA和ABA含量的变化趋势与基因PbGH3和PbNCED变化趋势基本吻合。

从基因方面来说，经高温胁迫后PbAPX、PbGH3和PbNCED基因表达量均发生了显著变化，带动植物体内相对应的ASA、IAA和ABA含量变化，从而抵抗高温胁迫。‘黄冠’中的PbGH3表达量在受高温胁迫后的含量显著高于‘翠玉’，且‘黄冠’中的相关基因表达量与相应的物质含量的相关性要高于‘翠玉’，从而说明‘黄冠’针对高温胁迫的反应能力要强于‘翠玉’。